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细胞生物学Cell Biology

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抗体的选择和保存指南

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  • 發布日期:2015-05-04

抗體的選擇和保存指南

 

當我們要檢測目的蛋白在組織中表達情況的時候,如何選擇適合我們實驗需要的抗體,并恰當保存使用,是每個科研人員需要細心考慮的。抗體種類繁多,品牌眾 多,技術參數不一,價格和質量更是相差甚大,如何購買到高質量價格合適的抗體,并準確地做出我們想要的結果,其中有很多細節需要注意。
 
一、怎樣選擇適合你實驗需要的抗體?
1. 一抗選擇要點
(1)確定抗體的名字,注意中英文名字、它名、亞型等信息。
(2)確定你的實驗類型,Elisa,WB,IHC,ICC,還是FACS。一般抗體的說明書都會列出該抗體經驗證過適用于何種實驗的類型,如果抗體說明 書沒有提及的應用類型,并不意味著該抗體不適用于此種分析應用類型,而僅是說明尚未經過此種實驗驗證,請根據說明書列出的已驗證的類型來選擇適合你實驗的 抗體。
(3)確定實驗樣本的種屬,Human,Mouse,還是Rat。一般抗體說明書都列出該抗體經試驗驗證過適用于何種物種實驗,請根據說明書列出已驗證的種屬來選擇適合你實驗的抗體。
(4)樣本蛋白的結構性質。了解樣本蛋白的結構性質有助于選擇最合適的抗體,待測樣本蛋白的結構域和樣本在提取和處理過程中是否會變性,蛋白空間構象的改變,會影響抗體的免疫親和反應。
(5)單多克隆抗體的選擇。市面上的抗體還是以多克隆抗體為主,一般單克隆抗體特異性強,但親和力相對小,檢測抗原靈敏度相對就低;而多克隆抗體特異性稍弱,但抗體的親和力強,靈敏度高,但易出現非特異性染色(可以通過封閉等避免)。
 
2. 二抗選擇要點
(1)種屬來源。主要根據一抗種屬來源來決定購買二抗來源,如一抗是小鼠來源,那二抗就買抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。
(2)標記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標記物。一般SP三步法二抗選擇Biotin標記的二抗,以與后面的SP結合反應,而免疫熒光染色就需要購買不同熒光素標記的二抗,如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。
 
二、抗體的穩定性
1. 抗體的穩定性是自然界長期進化的結果。抗體是免疫系統中最重要的分子之一,其穩定性是自然進化篩選的結果。在眾多物種中,抗體分子形成了保守而穩定的結構。
2. 抗體分子的高Tm值。在室溫下,甚至短時間溫度達到50-60℃,抗體分子都能維持正確折疊,保持應有的活性。
3. 抗體的純度。采用先進的抗體純化技術,確保抗體產品的高純度,保障其抗體產品的穩定性。
4. 抗體的濃度。高濃度的抗體產品可減少容器表面吸附造成的物質損失,高濃度的抗體穩定性更好,抗體產品中93%的濃度大于0.5mg/ml。
 
三、怎樣確定抗體購買渠道和品牌?
國外著名抗體品牌的質量一般沒問題,但價格較貴,而且很多抗體品牌本身不生產抗體,所以能找到OEM抗體生產商生產的原裝進口抗體,隨著網絡技術的越來越普及,我們自己就可以通 過國內外的相關網站來檢索,國外最大的生物試劑查詢網站:biocompare,國內最大的生物試劑查詢網站:丁香通,來查找我們所需要的產品資料。
 
四、怎樣保存已獲得的抗體?
抗體無論是保存還是運輸都應盡可能地避免反復凍融,收到抗體后請根據實驗的需要,對抗體進行分裝,避免同一管抗體反復凍融(反復凍融會導致抗體空間結構變 性,導致多聚體形成,從而降低抗體的結合能力)。抗體保存得當與否,直接決定了抗體的活性和使用效果,如果抗體保存得當,抗體活性大部分都可以維持數年。 請謹記,無論何時請按照說明書推薦的保存條件正確處理和保存抗體。
 
1. 收到抗體后,請務必在4℃,12000rpm,離心3分鐘,(無論是液體還是凍干粉狀態),再打開管蓋進行分裝和保存(如果抗體體積小于50ul,請延長 離心時間至5分鐘,以保證全部抗體均離心下來)。抗體一般使用特制的儲存管,只有在12000rpm離心3分鐘,才能將附著在管壁或蓋內的抗體全部離心下 來(即使是在10000rpm離心也會離心不完全,導致出現抗體的量不足的現象)。
 
2. 對于ProSci大部分抗體,比較合適的保存方式是,分裝后保存在-20℃或者-80℃。
(1)對絕大多數抗體來說,保存在-20℃就完全足夠了,沒有任何證據顯示保存在-80℃會更好。
(2)分裝可以最大程度的降低反復凍融對抗體活性的損害,同時也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。
(3)分裝的量以一次實驗用完為好,最少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小,抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響。
(4)復融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來。
(5)抗體工作液應該當天配制當天用完,4℃保存盡量不要超過1天。
(6)絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中,將抗體保存在冰箱里層,避免溫度變化造成反復凍融。
 
3. 大部分抗體收到后4℃短暫保存1~2周對抗體活性沒有影響。
 
4. 大部分抗體的運輸條件:一般的運輸過程需要1~2周的時間,所以是在低溫4℃的條件下來完成的。
4℃運輸最主要的目的是為了避免反復凍融對抗體活性的損害(如果使用干冰運輸,那么收到時抗體是凍起來的,為了分裝就需要解凍,這就多了一次凍融的過程),所以運輸過程中絕對避免干冰運輸。
 
關于疊氮化鈉(sodium azide)的使用:
為了防止微生物污染,疊氮化鈉經常被加入到抗體中(終濃度0.02% (w/v))。ProSci的絕大部分抗體已經含有了0.02%-0.05%的疊氮化鈉,在說明書的儲存緩沖液中有標明。
 
注:疊氮化鈉的去除方式
可以通過凝膠電泳或過濾的方式去除,IgG的分子量是150kDa(IgM約600kDa);疊氮化鈉的分子量只有65Da,使用截留分子量為14kDa的濾膜即可將疊氮化鈉從抗體中去除。
 

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