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分子生物学Molecule Biology

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TRIzol RNA提取方法

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  • 發布日期:2014-07-14

 TRIzol RNA提取

(一)試劑準備

1.TRIzol試劑。
  2.氯仿
  3.異丙醇
  4.75%乙醇(DEPC H2O配制)
  5.DEPC H2O

(二)操作步驟

1. 樣品處理:
  (1)培養細胞:收獲細胞1-5×107,移入1.5ml離心管中,加入1ml Trizol,混勻,室溫靜置5min。
  (2)組織:取50-100mg組織(新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可)置1.5ml離心管中,加入1ml Trizol充分勻漿,室溫靜置5min。
  2.加入0.2ml氯仿,振蕩15s,靜置2min。
  3.4℃離心,12000g×15min,取上清。
  4.加入0.5ml異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置10min。
  5.4℃離心,12000g×10min,棄上清。
  6.加入1ml 75%乙醇,輕輕洗滌沉淀。4℃,7500g×5min,棄上清。
  7. 晾干,加入適量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)。

(三)注意事項
  1.樣品量和Trizol的加入量一定要按步驟(1)的比例,不能隨意增加樣品量或減少Trizol量,否則會使內源性RNase的抑制不完全,導致RNA降解。
  2.實驗過程必須嚴格防止RNsae的污染。

二、總RNA定量

RNA定量方法與DNA定量相似。RNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此,可以用260nm波長分光測定RNA濃度,OD值為1相當于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑,用 ddH2O稀釋DNA樣品n倍并以ddH2O為空白對照,根據此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度:
  RNA(mg/ml)=40×OD260讀數×稀釋倍數(n)/1000

RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0,故根據OD260/OD280的比值可以估計RNA的純度。若比值較低,說明有殘余蛋白質存在;比值太高,則提示RNA有降解。

 

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