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GUS染液配置--X-gluc & MUG

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  • 發布日期:2014-04-07

一  染色液配置:

1XGluc母液:X-Gluc,用N-N-二甲基酰胺(DMF)配成20mM的貯存液,分裝成每管100μL,保存于-20℃。

2XGluc基液(50mM  PBS, pH7.0)。

 配制方法:

         50mM NaH2PO4·0.78g/100ml

                   50mM Na2HPO4 1.79g/100ml共同溶解; 

                 Na2EDTA 10mM372mg),

                 Triton-1000.1%,100μl

                 K3 [Fe(CN) 6] 鐵氰化鉀)(0.5mM16.5mg

                 K4 [Fe(CN) 6] 亞鐵氰化鉀)(0.5mM21.1mg

染色液50μl X-Gluc母液450μl基液

需要試劑:5--4--3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯XGluc) ;

N-N-二甲基甲酰胺(DMF) 

NaH2PO4; 

Na2HPO4 

Na2EDTA Triton-100; 

K3 [Fe(CN) 6] 鐵氰化鉀);

K4 [Fe(CN) 6] 亞鐵氰化鉀

二 染色方法:

1.將準備好的試材浸泡在染液,于2537℃保溫1小時至過夜。

2.葉片等綠色材料轉入70%乙醇中脫色23次,至陰性對照材料呈白色。

3.肉眼或顯微鏡下觀察,白色背景上的藍色小點即為Gus表達位點。

三 實驗原理

適宜的反應條件下,β葡萄糖苷酸酶(GUS)可將XGluc水解成藍色物質,因此具有GUS活性的部位或位點呈現藍色或藍色斑點,可用肉眼或顯微鏡觀察到。

gus基因是目前常用的一種報告基因,是β-D- 葡萄糖苷酸酶(gus)基因,其表達產物β-葡萄糖苷酸酶 (GUS)能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷酸 ,它可以將5--4--3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯(XGluc)分解為藍色的物質,也可以將4-甲基-傘形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解為藍色物質。 其檢測方法簡單、快速、靈敏、穩定,且背景活性低。

gus基因的最大優點是它能測定外源基因表達的具體細胞和組織部位,這是其它報告基因所不能及的。

四 注意事項

用于染色的植物材料的制備方法要因涉及的特定組織和器官的不同而異。例如,擬南芥的根、花和葉片以及煙草幼苗的根就可以不作任何預處理而直接染色。但是像煙草和馬鈴薯這些植物的莖和葉就必須在染色前切成薄片(1-3mm)。當操作大的組織和樣品時,可以選用真空滲入法來幫助底物和酶滲入細胞。


 

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