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细胞生物学Cell Biology

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膜蛋白抽提试剂盒大比拼

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  • 發布日期:2015-06-05

        G蛋白偶聯受體(GPCR)、整合素、離子通道蛋白……幾乎所有的膜蛋白都是研究熱點。當然,那是因為它們太重要了。作為細胞結構與功能的關鍵成分,它們擔當了很多重要角色。同時,這些蛋白也是重要的藥物靶點。然而,膜蛋白研究的道路上卻布滿了荊棘。無論是抽提、表達,還是后續的結晶、三維結構分析,都讓研究人員傷透腦筋。膜蛋白通過許多疏水氨基酸殘基錨定在膜結構里面,很難溶解在水性緩沖液系統中。為了制備膜蛋白樣品,傳統的方法是使用去污劑和表面活性劑增溶。但去污劑處理會使膜蛋白喪失其天然結構,因而又妨礙了膜蛋白的功能研究。 根據其明顯的疏水性特點,人們常用“去污劑+機械處理”的操作方法獲取膜蛋白,用于增溶的去污劑有離子型(如SDS)和非離子型的(如Triton-X)等。SDS會使多數蛋白完全變性,限制了很多下游分析。非離子型的去污劑較為溫和,但抽提膜蛋白(特別是有多個跨膜區的膜蛋白)的效果往往很差。如果有一種有效的膜蛋白抽提方法,既能保持膜蛋白的天然結構(或至少是活性結構),又有較高的產量和純度等優點,那將成為研究人員的福音。陸陸續續,多個公司都推出了膜蛋白抽提試劑盒,至于它們的性能如何,有哪些特點,來為你一一解析。

M品牌

       M公司推出的ProteoExtract 跨膜蛋白抽提試劑盒(簡稱為TM-PEK)是一種新穎的膜蛋白制備試劑盒。它是利用基于化學而非去污劑的方法來抽提膜蛋白,而得到的蛋白組分適用于各種常見的蛋白分析,如活性分析、天然和變性的凝膠電泳、Western Blot、免疫沉淀和質譜等等。 TM-PEK的抽提方法也很簡單,只有兩步。第一步,利用抽提緩沖液1來透化細胞或勻漿的組織,通過離心將可溶(胞質)組分與不可溶(膜)組分分離開。第二步,利用抽提緩沖液2A或2B將膜蛋白從脂雙層中抽提出。抽提緩沖液2A與2B的區別在于主角不同,分別為TM-PEK試劑A和TM-PEK試劑B,不過M公司并沒有說明這兩者的具體成分。抽提緩沖液2A非常溫和,適于脆弱的蛋白復合物。相比之下,2B則更為高效,適用于那些難對付的跨膜蛋白,特別是有多個跨膜區的頑固分子。哪怕是有7個跨膜區的Frizzled-4蛋白也能輕松搞定。你可以通過實驗摸索,根據目的蛋白的特點和下游應用來二選一。生物通Tips:如果是第一次使用TM-PEK,當然兩個試劑都要試。將同一個樣品分成兩份,進行平行試驗。由于2A較溫和,所以產率可能不及2B高,但對于活性分析等應用來說,則是更好的選擇。對于大部分跨膜蛋白,TM-PEK試劑A或B的2倍稀釋就已足夠。但如果抽提效果不理想,你也可以改變一下試劑A或B的濃度,從不稀釋到10倍稀釋,看看哪個的效果更好。與其他的膜蛋白抽提方法不同,TM-PEK試劑盒不需要超聲破碎、劇烈震蕩、超速離心或高溫孵育,這樣,目的蛋白受損的幾率就大大降低。每個TM-PEK試劑盒足夠處理40個樣品,2A 20個,2B 20個。每個樣品約為1-5×107個細胞或25-50 mg組織。價格為4600元,每個樣品的均價為115元。

S品牌

 

       S公司在蛋白抽提方面也有相當多的產品,只是宣傳不多,很多人都不太了解。它的ProteoPrep® Membrane Extraction Kit就專門用于膜蛋白的制備。制備過程如下:細胞重懸于低電導率的緩沖液如Na2CO3中,并通過超聲或其他方式破碎細胞。接著用超速離心讓膜蛋白沉降,棄上清,洗滌沉淀兩次,再用4型蛋白抽提試劑重懸膜蛋白。這個4型蛋白抽提試劑網羅了各種強力的增溶劑如尿素、硫脲、Trizma堿,此外,還增加了一種新型的兩性離子去污劑C7BzO,它能增溶多種類型的蛋白,包括膜蛋白。仔細看看這個過程,就知道此試劑盒是專門為雙向電泳而設計的,當然也就不考慮膜蛋白的活性了。試劑盒中還包含了還原劑三丁基磷以及烷基化試劑碘乙酰胺,分別還原和烷基化二硫鍵,能提高等電聚焦(IEF)的分辨率。如果你下游想做活性分析,這個kit顯然不適合你。 ProteoPrep Membrane Extraction Kit足夠對付6個樣品,1個樣品大約為20 mg凍干的大腸桿菌,或50-100 mg濕細胞,或250 mg組織。此試劑盒的價格為2572元。另外,對于盒中的4種試劑,Sigma都給出了貨號,可以單獨購買,這一點非常方便。

P品牌

        說到蛋白抽提,自然少不了P公司。Mem-PER® 真核膜蛋白抽提試劑盒就是專門從哺乳動物細胞或組織以及酵母細胞中富集膜蛋白的。試劑盒的成分很清爽,三種試劑-A、B、C。具體是什么試劑,那我可不知道,反正是去污劑。抽提過程也很簡單,先用去污劑A來裂解細胞,然后試劑B和C按一定比例混合,來溶解膜蛋白。短暫的離心之后,將這個混合物孵育在37°C,通過相分配將疏水蛋白與親水蛋白分離。疏水部分即膜蛋白沉在底部,上部則為親水部分。不過,上部也要保留,千萬不要想著棄上清,順手就扔了,因為可能還會做二次提取。在你得到的產物中,親水蛋白的比例不超過10%,交叉污染較小。步驟就是這么簡單了,大約1小時就能完成。提取效率當然也是因蛋白而異。據P公司介紹,能高效提取含1-2個跨膜區的蛋白。他們在三種不同的細胞系(NIH 3T3、Hela和C6)中驗證過,結論一致。 至于Mem-PER試劑盒的下游應用嘛,SDS-PAGE和Western blot當然沒問題。如果要做蛋白活性分析和純化,那么就要用透析來去除試劑C。如果要做雙向電泳的話,還得脫鹽、洗滌和富集。此試劑盒大概能用于70次的提取,每次5×106細胞或20 mg組織或15 mg濕酵母細胞沉淀。價格為2590元,相當于每次37元,價格相對較低。

 美國INVENT

 

        膜蛋白提取最新專利技術。全球最佳細胞膜提取產品。可以分離出天然膜蛋白(無表面活性劑和EDTA)。細胞/組織通過離心管柱的過程中,即可使細胞膜破裂,而無需使用傳統的勻漿器或或超聲波處理,無需超速離心,只需一臺微型離心機。本試劑盒可將細胞蛋白分成四個部分(胞核,胞漿,細胞器及細胞膜)。僅需很少的樣本量。此試劑盒為50次的提取量,每次1-50×106細胞或10-30mg組織。僅需不到45分鐘即可獲得高濃度膜蛋白(1-3mg/ml)。真正得到未變性的膜蛋白,無表面活性劑及EDTA,100%保留蛋白活性及蛋白間相互作用。所提取的膜蛋白加一滴水,在顯微鏡下看,可以觀察到膜還是在打轉的,跟在細胞里的狀態一樣的。所得到的膜蛋白除了可用于WB,SDS以及蛋白活性研究外,還可用于做質譜。

產品說明書


蛋白提取流程也很簡單:

 

實驗結果舉例:

 

與其他競爭品牌的對比:

盤點:

名稱

TM-PEK跨膜蛋白抽提試劑盒

ProteoPrep膜蛋白抽提試劑盒

Mem-PER真核膜蛋白抽提試劑盒

Minute膜蛋白提取試劑盒

優點

兩種不同的抽提試劑,適用于不同的膜蛋白和下游應用,使用靈活;高效提取多達7個跨膜區的蛋白

專門為雙向電泳而設計,還包含還原劑和烷基化試劑

步驟簡單,價格親民,能高效提取含1-2個跨膜區的蛋白

簡單,快速(<45 min 試驗步驟)

天然(Native) 細胞組份分離(細胞質細胞器和質膜)

真正未變性的膜蛋白 – 無表面活性劑及EDTA

100%保留蛋白活性及蛋白間相互作用

小樣本量

缺點

價格偏貴

需要超速離心;下游不能用于活性分析

要經過一定的處理才能進行活性分析或雙向電泳

上市時間短,新技術客戶聽說過的不多,價格稍貴

處理量

40個樣品,每個樣品約為1-5×107個細胞或25-50 mg組織

6個樣品,每個樣品約為20 mg凍干的大腸桿菌,或50-100 mg濕細胞,或250 mg組織

70個樣品,每個樣品為5×106細胞或20 mg組織或15 mg濕酵母細胞沉淀

50個樣本,每次1-50×106細胞或10-30mg組織

價格

4300

2589.21

2590

3217

廠家

M

S

P

INVENT

 


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