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分子生物学Molecule Biology

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qPCR常见问题

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  • 發布日期:2015-05-11

1. 定量PCR儀的開關機順序是怎樣的?

  按照正確的開關機順序操作,有助于延長儀器的使用壽命,減少儀器出故障的頻率。

  開機順序:先開電腦,待電腦完全啟動后再開啟定量PCR儀主機,等主機面板上的綠燈亮后即可打開定量PCR的收集軟件,進行實驗。

  關機順序:確認實驗已經結束后,首先關閉信號收集軟件,然后關掉定量PCR儀主機的電源,最后關閉電腦。

2. 哪些種類的反應管和蓋子適合定量PCR實驗使用?有何需要注意的地方?   

  定量PCR實驗可以使用以下耗材:96孔光學反應板配合光學膜,0.2 ml光學八聯反應管配合光學膜,0.2 ml光學八聯反應管配合平蓋的光學八聯管蓋。ABI公司生產的定量PCR耗材的具體使用方法和貨號見下表:

3. 為什么要定期對電腦進行磁盤碎片整理?怎樣整理?

  當運行實時定量PCR儀及使用軟件分析實驗結果時,計算機會刪除并創建若干文件,計算機硬盤的空閑空間會被分割成越來越多的小塊。當硬盤驅動器上文件以分解的碎片存儲時,程序需要更長的時間才能存取文件,因為必須多次尋找文件碎片以存取不同的片斷。碎片整理實用程序將一個文件分解開的多個碎片合并在一起,并存儲到硬盤的同一個位置,從而清除文件碎片,進而優化系統性能。

碎片整理的方法如下:

  · 在Windows桌面上,選擇開始(start),我的電腦(My computer)。

  · 在(我的電腦)窗口中,用鼠標右鍵單擊硬盤驅動器,并選擇(屬性)property。

  · 在(屬性)對話框中選擇工具(Tools)選項卡,單擊開始整理(Defragment now)。

  · 單擊碎片整理(Defragment)。

  · 當顯示“碎片整理完畢”對話框時,單擊(確定)。

  · 在“本地磁盤屬性”對話框中,單擊(確定)。

  · 為計算機機中剩余的驅動器重復如上步驟。

4. 何時執行windows service pack更新?

  不要執行該操作。除非美國應用生物系統公司代表通知您更新操作系統,否則請不要更新控制定量PCR 儀的計算機的操作系統。新版本的Microsoft Windows操作系統有可能與SDS 軟件存在沖突,并導致儀器不能正常運行。如果您希望安裝service pack(更新包)以更新操作系統,應查看隨SDS 軟件提供的版本說明,避免兼容性問題。

5. 應該備份哪些數據?

  應該定期備份您的實驗數據,備份頻率推薦每周一次,用光盤刻錄。同時您也應該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗證實驗數據,這些文件所在的目錄是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下圖是校正文件的樣本。



6.怎么樣的實驗室環境才能保證儀器設備正常運行?

  良好的實驗室環境有助于延長儀器的使用壽命,減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個方面:

  電源:推薦配備合適的UPS或穩壓器。

  通風:儀器的通風應該沒有阻擋。

  溫度:推薦實驗室配備空調,溫度應該控制在10-30°C之間。

  濕度:20-80%;對于潮濕的省份,推薦實驗室配備除濕機。

  空間:易于操作,安全。

7. 怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被污染?怎樣清除污染?

  一個辦法是運行背景校正反應板,當一個或多個反應孔連續顯示出不正常的高信號,則表明該孔可能被熒光污染物。

  另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下,執行ROI的校正,當某個孔的信號明顯高出其他孔時,則表明該孔被污染。

清除樣本加熱塊污染的步驟如下:

  用移液器吸取少量乙醇并滴入每個污染的反應孔中。

  吹打數次。

  將廢液吸入廢液杯中。

  重復以上步驟:乙醇三次,去離子水三次。

  確認反應孔中的殘留液體蒸發完。

8. 什么是背景校正?多長時間執行一次背景校正?

  背景校正程序測量定量PCR儀所使用的反應管和水的空白熒光強度。在運行校正程序期間,定量PCR儀在10分鐘內連續讀取背景校正板的熒光強度,信號收集的溫度為60°C。隨后,SDS軟件計算所收集到的熒光強度的平均值,提取結果并保存到校正文件中。軟件在今后的分析中將自動調用此校正文件,從實驗數據中扣除背景信號。

  因為背景熒光的信號強度隨著許多外界因素(比如外來的污染、反應板/反應管的生產廠商不同、水的純度等)而變化,所以推薦定期進行背景校正,一般每三個月到半年校正一次。

9. 什么是純熒光校正?多長時間校正一次?

 純熒光校正是測定各種純熒光染料標準品的波長和信號強度,通俗地說是讓儀器“認識”各種熒光染料。軟件收集并儲存各種純熒光染料標準品的熒光信息。以后每次定量實驗運行過程中,SDS軟件收集樣品的原始光譜信號,并將此原始光譜與純熒光文件中的數據進行比較,精確扣除不同染料的信號重疊部分,從而確定樣品中的熒光染料種類和信號強度。

  推薦每半年進行一次純熒光校正。在運行光譜校正之前,請先進行背景校正和ROI校正。

10.96孔板怎樣封膜?

  當使用96孔板做實驗的時候,推薦使用光學膜代替蓋子來密封反應孔。正確的封膜方法是:先沿著96孔板的縱向壓膜,然后橫向,最后沿著板的邊緣按壓使之密封。

11.使用單管或8連管做實驗時,在樣品加熱塊上應該怎樣安排放置?

  使用單管或8連管做實驗,并且樣本數量不多的時候,建議在樣品加熱塊(TRAY)上對稱地安放樣品,最好是縱向放置,并且優先放在第6列或第7列,然后逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來的時候不至于發生傾斜,各個反應管的受力和受熱都比較均勻,提高孔與孔之間的數據精密性.

12. 絕對定量與相對定量有什么區別?

  絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目,即通常所說的拷貝數。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例,而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數。

  舉例來說,如果研究項目中包括處理過的和未經處理的對照樣本,通常可以將未經處理的樣本指定為基準,規定其目的基因濃度為100%,將經處理的樣本的定量結果除以對照樣品的定量結果,就可以計算各個處理樣本的基因含量相對于未處理樣品的百分比。

  絕對定量實驗必須使用已知拷貝數的絕對標準品,必須做標準曲線。相對定量可以做標準曲線,也可以不做標準曲線。

  相對定量實驗有兩種方法:標準曲線法和CT值比較法。如果使用標準曲線法,可以使用絕對標準品,也可以使用相對標準品,而且相對標準品在實驗操作上更為簡便易行。相對標準品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數目的標準品,典型的做法是將一個已知pg數的樣品做一系列梯度稀釋。

   CT值比較法是利用CT值與起始DNA濃度的對數成反比的數學關系,來計算不同樣本之間的相對百分比,其計算公式是。

  絕對定量的數據易于理解,但是絕對標準品的制備和測定其DNA含量比較困難。有許多商業性的標準品試劑盒供選購,可以解決這種困難。

  相對定量的標準品容易在實驗室里自己制備,但是數據處理比較麻煩,對實驗數據的解釋有一定難度。

13. 定量PCR基因表達的實驗數據應該如何處理?

  總的來說,有三個層次的校正是必須要做的。

  首先,參比信號校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX,這樣由于反應總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的熒光信號波動都能夠被扣除,使數據真正反映PCR進程。ROX校正能夠極大地改進定量的精確度,提高重復管之間的數據重現性。

  其次,內對照校正。實驗中加入樣品基本上都是以體積為單位的,但是同樣體積的不同樣品很可能來自不同數目的細胞,所以將實驗結果校正到每個細胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因(如IL-2)的同時定量一個內對照基因(如18S RNA基因),然后IL-2/18S。內對照校正使不同樣品的實驗數據可以相互比較。

  第三,計算相對于基準樣品(Calibrator)的相對基因含量。比如研究處理和未處理的、0小時和6小時的、正常和患病的之間的基因表達的差別,則需要計算處理/未處理、6小時/0小時、患病/正常。

14. 標準曲線法相對定量的數據應該怎么處理?

  假設實驗的目標是研究藥物處理后0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達量的變化,所用的內對照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測定結果都是總RNA的pg數,數據的處理方法見下表:

15.什么是CT值比較法?數據怎么處理?

  CT值與起始DNA濃度的對數成反比:

  如果(1)不同管之間的PCR反應效率相同;(2)這些PCR的反應效率接近100%,可以從上面的公式推出相對含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假設實驗的目標是研究藥物處理后0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達量的變化,所用內對照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測定結果都是CT值,而沒有通過標準曲線測定總RNA的pg數。     

16. 每個反應管中可以加入多少種探針?

  每個反應管中可以加入的探針數目,取決于儀器、軟件、試劑和實驗設計等幾個方面。

  首先是儀器的硬件構成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下,全波長檢測的定量PCR儀如激光管-CCD類型對于探針的數量實際上是沒有限制的。如果信號的采集要通過濾色片,那么探針的數量取決于濾色片的數目,增加探針需要增加或改變濾色片。改動儀器的結構通常很困難。以AB公司的儀器為例,7900和7700是激光-全波長檢測的,7000、7300是4色濾色片的,7500是5色濾色片的。

  其次是化學上的可能性。不同的熒光基團要組合到一起,在同一反應管內使用,必須其激發波長既相對靠近又不能靠得太近,既保證信號激發的效率又保證信號不重疊干擾,能夠區分清楚。現已發現的熒光基團種類有限,滿足這樣條件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達到每組4到5種熒光的水平。

  第三是實驗方案的設計和選用的探針類型。定量PCR實驗必須使用ROX校正熒光,占去一種熒光;TaqMan探針的淬滅基團(TAMRA)也要占用一種熒光,對于4色檢測的儀器來說,只剩下2種熒光可以標記探針,對于5色檢測的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針,由于它的淬滅基團是不發熒光的,比之TaqMan探針就可以多1種熒光用于標記探針。如果實驗要求不高,不做ROX校正(AB公司不推薦這樣做),還可以再多一種熒光用于標記探針。

  第四是研究應用本身的要求。如果研究SNP和基因突變,因為絕大多數人類基因是2態的,只存在兩種等位基因,2條探針已經足夠。如果研究基因表達,通常是兩兩比較居多,比如處理比未處理,正常比異常等,加上一個內對照,3色也就足夠了。

  最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高數據精確度,二是節省反應成本。同時測定的基因越多,成本也越低。但是加入4-5種探針,就要同時加入8-10條引物。在引物設計的時候要考慮到盡量減少這些引物之間的競爭和抑制等多種干擾,平衡各對引物之間的PCR效率。雖然這是可以做到的,但是要花費大量時間、人力和物力來篩選最佳引物組合、優化反應條件。如果實驗規模不大,在總體上可能反而不合算。

  在實際應用中,不是單純追求加入的探針越多越好,而是追求總體效益的最優化。比較切合實際的是2到3重反應,引物和探針的設計不太困難,反應條件的優化也不太麻煩,同時降低了成本。

17. 等位基因鑒定實驗(比如SNP分型)是定性的研究,是否可以不進行ROX熒光校正?

不,等位基因鑒定實驗也要進行ROX熒光歸一,以保證實驗結果的精密可靠。

  由于試劑加樣操作的誤差、離心管熱量傳遞的誤差、離心管蓋透光性能的誤差等偶然因素是不可避免的,必然導致熒光激發效率的差異,因此儀器收集到的原始信號必須進行歸一化校正,相互之間才可以比較并保證重現性。



  這種校正是通過在反應緩沖液中添加ROX校正熒光來實現的。ROX在反應緩沖液中的濃度是固定的,因此其信號的高低變化只與上述物理方面變化的總體效應有關。將報告熒光的信號除以ROX熒光的信號,就能夠消除所有這些物理因素所引起的數據波動。

18. 內標法和外標法哪種數據更精密?

是同樣可靠的。內標的優點在于目標基因與管家基因的反應條件最接近一致,缺點在于目標基因與管家基因的引物和探針相互之間會發生競爭與抑制,導致它們的PCR效率有差異。外標的優點在于目標基因與管家基因的引物和探針之間沒有發生競爭與抑制的機會,但是不同管之間的反應條件差異比同管的要大,也會導致它們的PCR效率有差異。兩相比較,內標法與外標法的數據精確度是一樣的。

 

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